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八聚體錐形孔跨膜蛋白——MspA蛋白
恥垢分枝桿菌毒素蛋白（Mycobacterium smegmatisporin A, MspA）是一種通道形成蛋白，用于小分子和水的通道。MspA是分子量 20 kDa 的單體蛋白構建的同源性八聚體，其形狀為“八"字形杯狀結構。MspA長度大約 1 nm，具有大約1 nm的寬度收縮區，兩側有明顯較大的直徑區域。
MspA 擁有很好的化學穩定性和熱穩定性，在 100℃的溫度下活性能耐受 30 min，在80℃的2% SDS條件中培養15分鐘依然可以保持良好的通道活性，在 pH 0~14 的范圍內保持穩定，同時MspA具有易于進行多位點突變修飾。
圖1 MspA突變體的結構與表達
MspA是一種納米孔分析的理想材料
MspA 的幾何形狀可以提供很好的空間分辨率，因為離子電流阻塞的特征主要是由穿過孔隙狹窄區域的多核苷酸片段決定的。另外，MspA 擁有很好的化學穩定性和熱穩定性，最后，MspA可以為多種氨基酸替代保留高水平表達和通道活性，是一種通過定點誘變進行工程設計的理想選擇。近年來，MspA蛋白在單分子檢測領域的研究和應用得到越來越多關注，MspA蛋白納米孔最重要的應用集中在DNA測序方面，主要用于檢測表征ssDNA。
圖2 納米孔測序原理
MspA在生物和醫學展現應用潛力
MspA作為一種具有錐形結構的八聚體孔道蛋白，通過引入突變開發工程化MspA孔道，可以實現多種單糖直接區分，說明MspA是核酸與多種生物大分子檢測的有力品。
MspA是細菌細胞外膜上親水性營養溶質的主要通道，負電性密集的收縮區具有天冬氨酸的雙圈結構，能夠與陽離子結合。使用合適的通道阻斷劑可以堵塞MspA蛋白孔，則親水性營養溶質不能輸送進細菌體內，造成細菌休眠，同時可以破壞細胞外壁的穩定性，增強細菌的抗生素易感性，對于疾病治療具有重要作用。
圖3 MspA實現單糖區分
珀羅汀基于無細胞體系成功表達MspA八聚體跨膜蛋白
客戶案例
收到MspA序列后，珀羅汀構建融合了GFP的線性化表達模版，隨后，采用自主研發的PLD無細胞蛋白表達試劑盒（膜蛋白（或困難蛋白）表達增強版，#PLDK002）進行蛋白合成，蛋白合成后采用9種方案進行合適的表面活性劑篩選，對于目的蛋白的表達結果采用SDS-PAGE進行鑒定。
圖4 目的蛋白表達鑒定
（channel 1：空白對照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達情況；channel 11：marker）
之后，選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的無細胞蛋白表達體系進行第二輪優化。優化結果顯示，channel 5的無細胞蛋白表達方案可以正確表達該MspA的單體與多聚體。
圖5 MspA目的蛋白表達鑒定
客戶評價
這次選擇比較新穎的無細胞蛋白表達體系進行MspA表達，珀羅汀僅用4天完成小試，相當快速，膠圖結果中單體和多聚體的亞基都是對的。相比于細胞表達體系，無細胞體系可以輕松實現多亞基膜蛋白表達及正確組裝的難題。對于復雜多亞基超結構膜蛋白的結構研究和物理、化學、生物性質研究而言，這無疑是巨大的福音。
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Tom Z, Mikhail P,et al.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore. PNAS,doi 10.1073 (2008).
SY Zhang,ZY Cao,et al.A Nanopore-Based Saccharide Sensor. Angew.Chem. Int.Ed.doi.org/10.1002/anie.202203769 (2022).
Ayomi S. Perera,et al. Channel Blocking of MspA Revisited. Langmuir.doi.org/10.1021/la3037296 (2012).
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