蛋白質設計的目標是創建具有特定功能的蛋白質，目前，基于物理的方法雖然能夠提供詳細的結構信息，但成功率相對較低。相比之下，基于機器學習的方法顯著提高了設計的成功率，但設計失敗的情況仍然普遍。而且，無論采用哪種方法，最終都需要通過實驗來驗證設計的蛋白質是否具有預期的功能。當前主要的挑戰是從數十到數百個設計中篩選出那些具有預期功能的蛋白質，并且要明確設計失敗的原因，包括表達和可溶性問題以及未能形成正確的結構和功能的原因。因此，尋找一種高效、便捷的方法來篩選和驗證蛋白質設計顯得尤為重要。

無細胞蛋白合成（CFPS）提供了一種更為簡單的方法來識別功能性設計，并能解釋設計為何未能如預期般表現。CFPS相比在傳統生產重組蛋白的方法具有多個優勢，如不受宿主細胞存活限制、可生產細胞毒性蛋白、反應僅由目標DNA編程、條件易于調整、適合小體積篩選且成本低。此外，CFPS更便于生產制造和測試設計蛋白的功能，并探索設計失敗的原因，從而可以提供豐富的數據集以優化后續設計等。

在蛋白質設計中，篩選活性是關鍵步驟之一。CFPS作為一種高效且靈活的方法，在這一過程中發揮了重要作用，它可以快速評估蛋白質的活性，同時還能幫助識別設計失敗的原因。此外，CFPS可以在微孔板或微流控設備中進行，反應體積小，適合大規模篩選。例如，通過熒光或比色法可以直接檢測酶活性，而無需復雜的純化步驟。CFPS還可以用于高通量篩選，例如Rapp等人通過機器人自動化系統結合CFPS來探索蛋白質的熱穩定性和活性。這種方法不僅提高了篩選效率，還能夠在短時間內排除無效的設計。從而快速篩選出功能性蛋白質，還能為設計失敗提供寶貴的信息，從而指導后續的設計改進，例如，de los Santos等人通過CFPS篩選出具有特定DNA結合活性的轉錄抑制因子突變體，Rolf等人通過優化反應條件提高酶的可溶性產量?？傊?，CFPS是一種簡單、信息豐富且易于操作的技術，非常適合用于蛋白質設計和驗證流程。

蛋白質表面捕獲是評估蛋白質功能的重要手段。通過將蛋白質產品固定到固體表面上，可以將其與CFPS試劑分離，從而通過清洗表面實現這一目的。這使得可以在不同條件下測試蛋白質活性，如pH值、溫度、緩沖液成分以及對不同底物的反應性。并且可以測試每個突變體在多種條件下的表現。如，PISA（Protein In Situ Array）技術通過鎳涂層表面捕獲帶有His標簽的蛋白質，實現高通量功能檢測。最近，Thornton將自組裝蛋白質表面用于共價捕獲無細胞合成的蛋白質。具體來說，可通過His標簽蛋白、生物素化的DNA、BslA-SpyTag 形成自組裝蛋白質單層等策略來實現表面補獲。這些方法不僅能夠高效地捕獲蛋白質，還能夠在不同的實驗條件下進行蛋白質功能的測試，從而為蛋白質設計和功能研究提供了強大的工具。