非天然氨基酸（Unnatural Amino Acids, UAAs）技術通過擴展遺傳密碼，使研究者能夠在蛋白質中引入自然界不存在的化學基團，為蛋白標記、結構解析、反應活性調控及新材料構建提供未有的可能性^[1]。隨著 UAAs 工具箱的不斷豐富，該策略正在成為結構生物學、蛋白工程與生物藥開發中的關鍵技術手段。

近年來，無細胞蛋白表達（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）體系的快速發展，使 UAAs 的位點特異性插入效率、可控性與通量能力得到顯著提升，為膜蛋白、酶類蛋白及復雜復合蛋白的功能化研究打開了全新空間。

盡管細胞體系是生物學研究的基礎平臺，但在 UAAs 插入方面卻存在天然瓶頸：

1. 插入效率低且缺乏穩定性，部分 UAAs 在細胞內根本無法使用

2. 宿主細胞代謝對實驗條件具有嚴格限制

3. 對膜蛋白、毒性蛋白等難表達蛋白幾乎不可行

膜蛋白折疊復雜、要求特定微環境，而插入 UAAs 會進一步增加錯誤折疊與失活的風險；毒性蛋白則直接威脅宿主細胞的生存，使細胞體系難以維持表達流程。

綜上，細胞體系在 UAAs 插入方面難以實現可控、可重復、可擴展的實驗需求。

1. 開放體系，可精確調控，實現更高插入效率

CFPS 反應體系不受細胞膜與代謝網絡限制，實驗者可以直接調控：

圖1：無細胞蛋白表達體系示意圖

2. 對蛋白毒性不敏感，天然適用于膜蛋白與難表達蛋白

CFPS 無需維持細胞生命活動，因此：

這使 CFPS 成為膜蛋白 UAAs 修飾、難表達蛋白合成的重要平臺。

3. 易于構建高通量體系，適合蛋白工程與藥物篩選

CFPS 可在 96/384 孔板上實現數十至數百反應的并行開展，使以下任務在數小時內完成：

高通量 UAAs 操作讓CFPS 成為新材料開發、先導化合物篩選和定向進化中的關鍵加速工具。

圖2：珀羅汀非天然氨基酸插入案例

CFPS 技術正在從根本上改變 UAAs 插入和蛋白功能化研究的實驗范式。憑借其開放、高效、可控性強以及對膜蛋白友好的特性，無細胞體系已成為 UAAs 插入的理想平臺，特別適合：

[1] Liu CC, Schultz PG. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 2010;79:413-444..

[2] Silverman AD, Karim AS, Jewett MC. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 2020;21(3):151-170.

[3] Martin RW, Des Soye BJ, Kwon YC, et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nat Commun. 2018;9(1):1203.

[4] de la Torre D, Chin JW. Reprogramming the genetic code. Nat Rev Genet. 2021;22(3):169-184.